（一）酵母菌的分离
1．分离原理
在液体中，酵母菌的生长比霉菌快；酵母菌比细菌喜酸，适于酸性培养基；细菌对抗生素敏感，而酵母菌对抗生素不敏感。利用上述特性，可先降低大曲中的霉菌和细菌数量，使酵母菌占优势，再从中分离出酵母菌。
2．实验材料
固体曲，含0. 5%乳酸的酸性麦芽汁培养基试管，固体链霉素麦芽汁琼脂培养基。
3．操作
可采用平板划线分离，也可采用稀释平板法分离。
（二）根霉的分离
大曲中的根霉一般呈菌丝和孢子状态，蔓延繁殖在曲块中，而曲块本身结合得较紧密，所以由大曲直接稀释分离往往得不到理想的结果。为了保证分离到根霉，一般先选择一种培养基进行预培养，待长出菌丝和孢子囊后，再进行稀释分离和纯化。
1．根霉的分离
用酒精消毒研钵，放人大曲研磨至细。取少许大曲粉撒在馒头上，在28℃下培养l~2d，待馒头上长出菌丝和孢子囊后，挑取有代表性的根霉，接种到豆芽汁葡萄糖斜面培养基上，28℃培养2～3d，长成孢子囊后进行纯化。
2．根霉的纯化
上述分离得到的根霉一般不是纯种，需要进一步纯化。
用接种针挑取一小丛带几个孢子囊的菌丝，放入装有lOmL无菌水的第1试管中，打匀。再用接种环取1环至装有lOmL无菌水的第2试管中，摇匀。由第2试管取ImL加入至第3试管（装有lOmL无菌水）中。分别由第1试管、第2试管和第3试管中取0.5mL，接种到豆芽汁葡萄糖琼脂平板上。用玻璃刮刀刮平，28C培养17—18h。最后，接出单菌落于豆芽汁葡萄糖斜面上。若不纯，则再进行纯化。
若有条件，应进行根霉鉴定。一般根霉只要从培养特征和形态观察即可确定到属。
（三）曲霉菌的分离培养
曲霉菌的分离，不必像根霉那样需进行预培养，可直接用稀释法进行分离；黄曲霉可用察氏培养基分离培养；黑曲霉可用马丁培养基分离培养。
在培养基中加入0.1%链霉素或结晶紫，可抑制细菌的生长。
（四）窖泥微生物的分离
1．窖泥中己酸菌的分离
己酸菌为嫌气芽孢杆菌，分离前应先把样品进行热处理，杀死其营养体和非芽孢杆菌，再采用厌氧培养，反复纯化，即可获得纯菌种。
富集培养基：乙醇25mL，乙酸钠8g，MgCl2 0.2g，NH4 Cl 0.5g，MnSO4 0.0025g，CaSO4 0.Olg，FeSO4 0.005g，Na2MoO4 0.0025g，生物素5μg，对氨基苯甲酸100μg，pH7.0的Imol磷酸二氢钾一磷酸氢二钠25mL，含1%的硫化钠和0.05%碳酸钠溶液20mL。加蒸馏水到975mL。除乙醇外的其他成分混合后灭菌，乙醇在使用前单独加入。
分离用培养基：KH2PO4 0.04%，MgSO4·7H2O 0.02%，CaCO31%，乙酸钠0.5%，硫酸铵0. 05%，酵母膏0.1%，乙醇2%，pH7.0。除乙醇外的其他成分混合后灭菌，乙醇在使用前单独加入。
操作方法：取样品窖泥5g置于装有45mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡20min。静置5min后，逐级稀释成10-2、10-3、10-4、10-5不同浓度的菌悬液。取10-4~10-5浓度的茵悬液进行热处理(1Omin，80℃)。处理后的菌悬液用上述富集培养基培养7—8d至产气。然后挑取产气正常的试管转入新鲜富集培养液中培养7～1Od。根据镜检及己酸显色反应结果，选取产己酸的富集培养试样。将试样富集液80℃热处理5 min后，再用无菌水稀释至10-4~10-5，吸取不同浓度的稀释液进行平板分离，置于真空干燥器内(真空度80kPa)，35℃培养5d。挑取分离良好的单菌落，转移到试管富集培养基中，在真空条件下培养7d，选取产气试管，测定产己酸的量，将产己酸高者进行镜检，观察菌体形态一致者，可作为初筛菌。在初筛菌株中，选取产己酸量较高的菌株编号，并反复进行纯化，在确认为纯种后，再进行鉴定、保存。
己酸菌的形态特征是：长杆菌，单个存在，菌体大小为(0.8~1.0)μm×(3.0~5.0)μm；在固体培养基上，30℃培养48h后，芽孢端生（芽孢发育开始为近端生），芽孢呈圆形、椭圆形或膨大为梭状，周生鞭毛，兼性厌气，革兰阴性，固体深层菌落灰白色，边缘整齐。
2．窖泥中丁酸菌的分离
丁酸菌的分离原理与己酸菌基本相同，但丁酸菌的分离、富集培养基与己酸菌不同。
所用培养基如下：
富集培养基：牛肉膏15g，蛋白胨20g，葡萄糖30g，碳酸钙20g，蒸馏水lOOOmL，pH7.0。
分离培养基：牛肉膏lOg，葡萄糖50g，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，pH7.0。
操作方法：分离时采用平板划线分离，平板置于真空干燥器内（真空度为80kPa），33~35℃培养3d后，单菌落接种于富集培养基中，培养到产气为止。
丁酸菌在显微镜下为鼓槌状芽孢杆菌，长3.0μm，宽0.8μm。用碘液染色呈蓝色，而己酸菌不呈色，可据此特性区分丁酸菌和己酸菌。